網(wǎng)站標題

18665353180

當前位置：

產(chǎn)品與方案

聯(lián)系我們

張老師

18665353180

深圳市光明區鳳凰街道鳳凰社區招商局光明科技園A4棟1301

RRBS+RNA-seq（項目文章）

RRBS+RNA-seq案例：Nature Communications|李勁松等團隊揭示DNA甲基轉移酶蛋白在小鼠胚胎原腸運動(dòng)中的作用

參數日期：2024-02-20 17:44:46

新聞信息

日期：2024-02-20 17:44:46

作者：深圳市艾斯基因科技有限公司

分類(lèi)：DNA甲基化+轉錄（WGBS/RRBS+RNA-seq）

來(lái)源：www.thinknear.cn

瀏覽量：5723

我知道了

RRBS+RNA-seq（項目文章）

RRBS+RNA-seq案例：Nature Communications|李勁松等團隊揭示DNA甲基轉移酶蛋白在小鼠胚胎原腸運動(dòng)中的作用

日期：2024-02-20 17:44:46

作者：深圳市艾斯基因科技有限公司

分類(lèi)：DNA甲基化+轉錄（WGBS/RRBS+RNA-seq）

來(lái)源：www.thinknear.cn

瀏覽量：5723

WGBS+RNA-seq（項目文章）

DNA甲基化+轉錄（WGBS/RRBS+RNA-seq）

在小鼠的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，DNA甲基轉移酶蛋白（DNMT1）和雙加氧酶家族蛋白（TET）家族會(huì )動(dòng)態(tài)調控DNA胞嘧啶上第五個(gè)碳原子的甲基化（5mC）。隨著(zhù)受精的進(jìn)行，精子和卵子中攜帶的配子源的5mC會(huì )逐漸被去除，直到囊胚階段達到最低點(diǎn)。在著(zhù)床后，DNMT3A和DNMT3B介導的重頭甲基化作用下，DNA甲基化水平達到成年水平，并且DNMT1維持DNA甲基化的功能使胚胎在細胞分裂的過(guò)程中保持高度DNA甲基化的狀態(tài)。已有研究表明，敲除TET家族蛋白（TET1/2/3）會(huì )導致小鼠原腸運動(dòng)失敗，而Dnmt1或Dnmt3a/3b突變體的小鼠胚胎則可能在發(fā)育中期（E9.5）發(fā)生胚胎致死現象。盡管已經(jīng)產(chǎn)生了缺乏DNA甲基化的小鼠胚胎干細胞和滋養層干細胞系，這些細胞仍然展示出正常的自我更新能力。然而，目前尚未構建出DNA甲基化完全缺失的胚胎，這使得早期胚胎發(fā)育的功能和機制仍未被完全闡釋。

2023年5月22日，中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng )新中心李勁松研究團隊、徐國良研究團隊、吳立剛研究團隊、以及北京大學(xué)湯富酬研究團隊共同通訊在Nature Communications發(fā)表題目為“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”的研究論文。該研究通過(guò)篩選可以有效引入終止密碼子的堿基編輯器，建立了受精卵中多個(gè)內源基因同時(shí)失活的系統，揭示了啟動(dòng)子甲基化與抑制miRNA表達之間的表觀(guān)遺傳相關(guān)性。

英文標題：Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation

中文標題：堿基編輯介導一步失活Dnmt基因家族揭示DNA甲基化在小鼠原腸形成期間的重要作用

發(fā)表時(shí)間：2023年5月22日

發(fā)表期刊：Nature Communications (IF = 17.6 / SCI一區)

技術(shù)方案：WGBS、RNA-seq、CAS-seq等

研究?jì)热?/section>

該研究建立了小鼠受精卵中基于高效胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）的多基因同時(shí)敲除系統（inactivation of multiple genes in zygotes，IMGZ），并利用IMGZ系統構建Tet/Dnmt家族基因多種組合敲除的胚胎，探討早期胚胎發(fā)育中甲基化和去甲基化的作用，發(fā)現DNMT家族蛋白介導的DNA甲基化在小鼠原腸運動(dòng)中的重要作用且不依賴(lài)于TET蛋白介導的DNA去甲基化的功能。進(jìn)一步揭示Dnmt缺失胚胎中部分miRNAs啟動(dòng)子區域甲基化的完全缺失導致miRNAs的表達劑量上調，部分參與導致的小鼠原腸運動(dòng)失敗。

首先，為了實(shí)現在合子胚胎中高效的雙等位基因突變，研究在受精卵中比較了6個(gè)已報道的CBE系統（BE3，Gam-BE4，hA3A-BE3-Y130F，hA3A-eBE3-Y130F，X-BE3和X-BE4）靶向EGFP和Crygc基因后產(chǎn)生終止密碼子的能力，發(fā)現hA3A-eBE3-Y130F能高效地產(chǎn)生單個(gè)基因的純合敲除胚胎（>90%），且在胚胎中只產(chǎn)生低頻、隨機的SNVs脫靶現象（圖1）。接著(zhù)建立了基于hA3A-eBE3-Y130F的IMGZ系統，以有效地產(chǎn)生Tet和Dnmt家族基因之間具有多個(gè)突變基因的胚胎。

圖1 篩選高效堿基編輯器并分析其脫靶效應

然后，研究人員利用IMGZ系統獲得了Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎，通過(guò)這些突變胚胎，發(fā)現Dnmt家族基因通過(guò)調節miRNA的劑量在胚胎原腸發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。（圖2）

圖2 IMGZ介導的Dnmt1/3a/3b失活揭示了DNA甲基化在小鼠原腸胚形成中的關(guān)鍵作用

為了進(jìn)一步探究TET蛋白介導的DNA去甲基化與DNMT介導的DNA甲基化在發(fā)育過(guò)程的作用，研究構建了Tet/Dnmt1-4KO、Tet/Dnmt3a/3b-5KO和Tet/Dnmt-6KO的胚胎。結果顯示這些胚胎發(fā)育的形態(tài)變化，甲基化及其分布，與Tet存在的Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎非常相似，表明TET家族蛋白對胚胎發(fā)育的調控不依賴(lài)與DNMT家族蛋白。(圖3)

圖3 DNA甲基化參與原腸形成，與DNA去甲基化無(wú)關(guān)

為了探究Dnmt-null影響胚胎原腸運動(dòng)發(fā)生的分子機制，研究人員通過(guò)對Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null胚胎進(jìn)行分別進(jìn)行全基因組甲基化和轉錄組測序，發(fā)現DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相關(guān)基因啟動(dòng)子具有高甲基化模式，而相關(guān)編碼基因表達基本不被甲基化缺失影響，但其中大量的miRNAs啟動(dòng)子區域表現出高甲基化。

圖4 DNMT1、DNMT3A和DNMT3B共有的高甲基化啟動(dòng)子與胚胎發(fā)育相關(guān)

最后，研究團隊利用微量小RNA測序系統（Cas9-assisted small RNA-sequencing，CAS-seq）鑒定這些胚胎中的miRNAs豐度。結果顯示Dnmt-null的胚胎中具有高甲基化啟動(dòng)子的miRNAs表達都增加，大部分位于調控區域Dlk1-Dio3，表明了Dlk1-Dio3調控區域的DNA甲基化差異會(huì )影響miRNA的表達。而回補實(shí)驗則提示這些上調的miRNAs在抑制Dnmt-null胚胎發(fā)生原腸運動(dòng)中具有重要作用。(圖5)

圖5 由DNA甲基化介導的miRNA表達抑制微調了原腸形成

研究小結

綜上，該研究結果提供了體內證據支持DNA甲基化介導的精確的整體miRNA劑量參與了基因表達的微調，揭示了啟動(dòng)子甲基化與抑制miRNA表達之間的表觀(guān)遺傳相關(guān)性，并證明IMGZ可以加速破譯體內多個(gè)基因的功能。

參考文獻：

1.Li, Q. et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun 14, 2922 (2023).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38528-z